Injection sous-rétinienne de vecteurs viraux dans l’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle murin

Dans cet article

Résumé

Source : Park, S. W., et al. Approche limbique-injection sous-rétinienne de vecteurs viraux pour la thérapie génique chez l’épithélium pigmentaire rétinien de souris. J. Vis. Exp. (2015)

La vidéo décrit la méthode d’injection sous-rétinienne de vecteurs viraux dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans un modèle murin. Il détaille la procédure, de l’anesthésie et de la préparation oculaire à l’administration précise du vecteur lentiviral, assurant l’intégration et l’expression des gènes dans l’EPR.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation du kit d’injection et des vecteurs viraux

Préparez la seringue d’un microlitre équipée d’une aiguille émoussée de 33 G stérilisée à l’aide d’oxyde d’éthylène. Diluer les vecteurs viraux dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) pour obtenir un titre adéquat dans le microtube (c.-à-d. 1 x 10⁶ TU/μl). Rincez la seringue plusieurs fois avec des vecteurs viraux pour éliminer tout espace mort dans la seringue.

2. Injection sous-rétinienne de vecteurs viraux

Anesthésier les souris adultes (c’est-à-dire âgées de 6 à 8 semaines) avec une injection intrapéritonéale du mélange de tilétamine et de zolazépam (1:1, 2,25 mg/kg de poids corporel) et de chlorhydrate de xylazine (0,7 mg/kg de poids corporel) ou un autre régime d’anesthésie approprié.
Dilater les pupilles avec un collyre de phényléphrine 0,5 % et de tropicamide 0,5 %.
Préparez la seringue d’un microlitre en la chargeant de 1,5 à 2 μl de vecteurs viraux.
Ouvrez la paupière et faites saillir l’œil pour exposer l’équateur pour une injection pratique. Concentrez-vous dessus sous le microscope opératoire. Maintenez la position de l’œil saillant jusqu’à la fin de l’injection, sinon un déplacement de l’aiguille peut se produire pendant l’injection. Pour maintenir fermement le globe oculaire, placez les doigts à l’extérieur du bord orbitaire.
Appliquez une goutte de solution viscoélastique ophtalmique sur la surface de la cornée.
Placez une petite lame de couverture ronde sur le dessus de la cornée pour visualiser la rétine.
Percez un petit trou au niveau du léger postérieur du limbe à l’aide d’une aiguille stérile de 30 G 1/2 pour une injection sous-rétinienne supplémentaire. Pour plus de commodité, faites en sorte que le trou soit inférieur pour l’œil droit et supérieur pour l’œil gauche.
REMARQUE : Si le trou est fait au niveau temporal ou nasal, il est difficile d’être couvert par la paupière après l’injection. La ponction initiale doit être faite légèrement en arrière du limbe pour éviter les vaisseaux limbiques qui courent le long du limbe et peuvent être facilement reconnus. Attention à ne pas heurter l’objectif avec une aiguille lors de la perforation initiale. N’insérez pas tout le biseau de l’aiguille pour éviter la perforation de l’objectif.
Placez l’aiguille émoussée de 33 G de la seringue d’un microlitre à travers le trou pré-perforé et approchez-vous de l’aiguille dans l’espace sous-rétinien jusqu’à ce qu’une légère résistance se fasse sentir.
REMARQUE : Pour l’injection sous-rétinienne, le meilleur angle d’approche de l’aiguille est d’environ 45 degrés contre le plan de l’iris, et l’aiguille émoussée doit être poussée vers l’arrière vers la zone péripapillaire. Le carré pointillé indique le trajet suggéré de l’aiguille à travers la cavité vitrée pour l’injection sous-rétinienne à la figure 1.
REMARQUE : Il n’y aura pas de résistance ressentie lors du perçage (ou du passage) des couches rétiniennes car elles sont très douces. Ainsi, la première sensation de légère résistance indique que l’aiguille a déjà touché la couche d’EPR (épithélium pigmentaire rétinien) et que l’insertion de l’aiguille doit être arrêtée. Veillez à ne pas pénétrer le tissu scléral avec une pression excessive car l’aiguille doit être placée dans l’espace sous-rétinien potentiel. Si l’aiguille perfore le tissu scléral par une puissance excessive, elle pénètre dans les espaces orbitaires extraoculaires sans résistance. (Cette étape est cruciale)
Injectez doucement les vecteurs viraux (p. ex., 1 x 10⁶TU/μl) dans l’espace sous-rétinien sans tremblement pour éviter des lésions tissulaires indésirables. Ensuite, retirez l’aiguille doucement. Tenez fermement le globe oculaire pendant l’injection, comme décrit au point 2.4.
Observez la formation de bulles sous-rétiniennes après l’injection au microscope opératoire pour vous assurer qu’il n’y a pas de saignement rétinien.

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Résultats

Figure 1. Schéma de principe de l’injection sous-rétinienne. Coupe transversale de l’œil de souris colorée à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) représentant les structures avec une voie d’aiguille pour l’injection sous-rétinien...